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本试剂盒适用于快速提取各种细胞组织miRNA和其它各种小RNA。本试剂盒采用独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除，最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15 -30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
  
• 也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。
  
• 快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

• Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后，可以在常温保存一个月，如果要更长时间保存，请存放在4℃，但是使用前，应该先回复到室温。
  
• Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。
  
• 运输在常温下进行，不影响使用效果。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
  
• 需要自备乙醇，氯仿，一次性注射器，研钵。
  
• Lysis/Binding buffer和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

• 组织培养细胞
  
  • 收集<10⁷悬浮细胞到一个1.5mL离心管。（对于贴壁细胞，孔板培养和细胞瓶培养可以直接裂解，尽可能吸干净所有培养液残留后直接加入1mL的Lysis/Binding buffer，迅速轻摇使Lysis/Binding buffer充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶，轻轻用移液枪反复吹打混匀接操作步骤项下3。）
    
  • 13000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
    
  • 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入1mL Lysis/Binding buffer，涡旋或者吹打，充分裂解混匀。
    
  • 接操作步骤项下3。
• 动物组织（例如鼠肝脑）
  
  • 新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，根据处理组织的质量，按照50～100mg加入1mL的比例加入Lysis/Binding buffer后电动或者手动彻底匀浆。或者在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉（约50～100mg）转入装有1mL Lysis/Binding buffer的1.5mL离心管中，剧烈吹打涡旋混匀。
    
  • 可选，一般不需要：如果处理量大，有明显颗粒或者不溶物，非常粘稠或者裂解不充分，可立即用带针头的一次性5mL(约0.9mm针头)注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
    
  • 接操作步骤项下3。
• 室温放置5分钟以充分分离核酸蛋白复合物。
  
• 加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒。
  
• 室温放置2～3分钟，13000rpm离心10分钟。
  
• 小心取上清（约600μL）转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇（必须是室温的，通常900μL），涡旋混匀。此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心，立刻接下步。
  
• 将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12000rpm离心30～60秒，弃掉废液。
  
• 加700μL Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加入500μL Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL Wash Solution 2/3，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase-free water（事先在100℃水浴中预热效果更好），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
  
• 如果预期RNA产量>30μg，加30～50μL RNase-free water重复步骤11，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
  
  • 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15～30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。

• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
    
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
    
  • RNA在裂解液中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
• RNA纯度及浓度检测：
  
  • 完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
    
  • 纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数(10mM Tris,pH7.5)在1.8～2.1之间。OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris(pH7.5)中测出的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
    
  • 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀,OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
    
    终浓度（ng/μL）= (OD₂₆₀)×(稀释倍数n)×40
• microRNA富集方法（仅仅提取microRNA，不包含>200nt其它总RNA成分）
  
  • 不同的实验可以选择不同的方法，例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等，可能减少某些下游试验的扩增背景，当背景较高或者非特异扩增较多时，可以尝试使用富集方法提取的microRNA。
  • 按照前面标准操作步骤1～5操作，直到得到上清。
    
  • 较精确估计上清体积（约600μL），加入等体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。
    
  • 将混合物加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12000rpm离心30～60秒，收集滤过物。将滤过物从收集管转移到一个新的离心管后，把吸附柱子放回空的收集管内，再加入剩下的混合物，离心，收集滤过物。合并两次滤过物，计算体积。
    
    • 此时，滤过物含有microRNA，吸附柱子上面是除去了microRNA的总RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面标准操作步骤8～11操作漂洗，洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。
  • 较精确估计滤过物体积，加入0.65倍体积无水乙醇（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。
    
  • 取一套新的microRNA吸附柱MA，将上一步骤混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入microRNA吸附柱MA中，（吸附柱放入收集管中）12000rpm离心30秒，弃掉废液。
    
  • 按照前面标准操作步骤8～11操作漂洗，洗脱得到富集的microRNA。